La topographie, manipulée, est adaptée au désir de montrer ensemble les lieux principaux de cette tragédie. On reconnaît à gauche l'église du couvent des Grands-Augustins (aujourd’hui disparue) où sonna le tocsin qui déclencha les tueries, la Seine et le pont des Meuniers. Au centre à l'arrière-plan, le Louvre et, devant le bâtiment, Catherine de Médicis la veuve noire, principale instigatrice des massacres. Au centre au second plan, l'hôtel particulier dans lequel l’amiral de Coligny, chef du parti protestant, est tué avant d’être défenestré, décapité et émasculé. Réunis autour de son cadavre, les chefs du parti catholique, les ducs de Guise et d’Aumale et le chevalier d’Angoulême. À droite à l'arrière-plan, la porte Saint-Honoré et, sur la colline de La Villette, le gibet de Montfaucon, où le corps de l'amiral sera pendu par les pieds. Rassemblant plus de 150 figures, l’œuvre est un véritable catalogue de la cruauté en période de guerre civile. Femme enceinte éventrée (à droite du tableau au second plan), enfants traînant un nourrisson au bout d’une corde (au second plan au centre, à droite du pont des Meuniers), femme embrochée sur une pique de rôtisseur (juste derrière les enfants traînant le nourrisson), cadavres dénudés et empilés (notamment aux pieds de Catherine de Médicis), maisons pillées (derrière les chefs catholiques). Le roi Charles IX tire à l’arquebuse sur ses propres sujets depuis une fenêtre du Louvre (probablement de la tour de gauche du bâtiment). Ce tableau est tout à fait exceptionnel en raison de la qualité de son exécution, mais aussi parce que les représentations contemporaines des massacres de la Saint-Barthélemy sont très rares. Il porte la signature du peintre François Dubois, protestant d’Amiens réfugié à Genève après les massacres.