Redigerer Western blot

[[Fil:Anti-lipoic acid immunoblot.png|thumb|Western blot using an [[antibody]] that recognizes proteins modified with [[lipoic acid]]]]
'''Western blot''', ''WB'' eller '''Western blotting''', eller ''immunoblot'', er en vanlig [[molekylærbiologi]]sk metode som benyttes innen proteinkjemien for å detektere og identifisere spesifikke [[protein]]er med hjelp av [[antistoff]]er. Western blot benyttes i prinsippet ved alle laboratorier som bedriver biomedisinsk og biomolekylær forskning, men også ved klinisk [[diagnose|medisinsk diagnostikk]] i visse sammenhenger.

==Uttrykket ''Western blot''==
Uttrykket er dannet i analogi med [[Southern blot]], som er en lignende metode for å detektere DNA. Den metoden ble oppkalt etter sin opphavsmann, den engelske biologen [[Edwin Southern]]. På lignende måte foretar man deteksjon av RNA med en metode som kalles [[Northern blot]].<ref name=Stark1977>{{cite journal |vauthors=Alwine J, Kemp D, Stark G |title=Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes |url=https://archive.org/details/sim_proceedings-of-the-national-academy-of-sciences-usa_1977-12_74_12/page/5350 |journal=Proceedings of the National Academy of Sciences USA |volume=74 |issue=12 |pages=5350–5354 |year=1977 |pmid=414220 |doi=10.1073/pnas.74.12.5350 |pmc=431715|bibcode=1977PNAS...74.5350A }}</ref> Det var W. Neal Burnette som i 1981 begynte å bruke uttrykket «western blot»,<ref name=Burnette1981>{{Cite journal |author=Burnette WN. |title='Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A |journal=Analytical Biochemistry |year=1981 |volume=112 |issue=2 |pages=195–203 |issn=0003-2697 |pmid=6266278 |doi=10.1016/0003-2697(81)90281-5}}</ref> men selve metoden oppstod i 1979 i Harry Towbins laboratorium ved [[Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research|Friedrich Miescher Institute]] i [[Basel]] i [[Sveits]].<ref name=Towbin1979>{{cite journal |vauthors=Towbin H, Staehelin T, Gordon J |title=Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications |url=https://archive.org/details/sim_proceedings-of-the-national-academy-of-sciences-usa_1979-09_76_9/page/4350 |journal=Proceedings of the National Academy of Sciences USA |volume=76 |issue=9 |pages=4350–54 |year=1979 |pmid=388439 |doi=10.1073/pnas.76.9.4350 |pmc=411572|bibcode=1979PNAS...76.4350T }}</ref>

== Fremgangsmåte ==
Det første steget ved en WB-analyse er å frembringe proteininnholdet fra de [[celle]]r eller [[vev]] som skal studeres. For å kunne separere proteinene fra cellenes andre bestanddeler må man første behandle celler og vev slik at de kan analyseres. Vevprøver kan nedbrytes i en [[homogenisator]] eller med [[ultrasonikering]]. Celler kan behandles på samme måte som vev, eller ''lyseres''. Lysering av celler skjer ved at [[cellemembran]]en løses opp med en [[detergent]]. Lysatet man har utvunnet [[sentrifugering|sentrifugeres]] for å separere proteinene fra [[lipid]]er, [[cellekjerne]]r og andre cellestrukturer.

Proteinene i lysatet separeres deretter med [[SDS-PAGE]], en metode som separerer proteiner med hensyn til [[molekylmasse]] (eller molekylærvekt) som for proteiner måles i [[Atommasseenhet|Dalton]] (angis oftest med prefikset kilo, kDa). [[Natriumdodecylsulfat|SDS]] binder og denaturerer proteiner, og gjør dem negativt ladet. Proteinene får vandre i et elektrisk felt ved en [[polyakrylamid]]<nowiki></nowiki>gel, der de separeres.

Neste steg, kalt ''blotting'', er å overføre proteinene til en [[nitrocellulose]]- eller [[polyvinylidendifluorid]]membran (PVDF) med hjelp av en elektrisk spenning. Når proteinene er blitt overført, blokkes membranen for å forhindre uspesifikk binding av antistoffene til membranens overflate. Vanlige blokkløsninger lages av [[bovint serumalbumin]] (BSA) eller fettfri [[tørrmelk]]. 
 
Etter blokkingen appliseres et spesifikt antistoff (''primært antistoff'') på membranen, hvis spesifisitet gjør at det binder til det proteinet som er av interesse. Deretter appliseres et ''sekundært antistoff'' som binder til det primære antistoffet. Det sekundære antistoffet er lenket til et [[enzym]] hvis katalytiske egenskap omdanner et [[Substrat (kjemi)|substrat]] til et [[reaksjonsprodukt]] som kan detekteres, enten ved at man ser et fargeomslag på membranen, eller indirekte ved at man sender ut [[Luminescens|kjemiluminescent]] lys som kan fanges på lyssensitiv film, sees med [[CCD]]-kamera eller med en type [[phosphorimager]].

==Referanser==
<references/>
== Eksterne lenker ==
* {{Commonscat}}
* {{cite journal|last1=Yang|first1=Ping-Chang|last2=Mahmood|first2=Tahrin|title=Western blot: Technique, theory, and trouble shooting|journal=North American Journal of Medical Sciences|volume=4|issue=9|year=2012|pages=429|issn=1947-2714|doi=10.4103/1947-2714.100998|pmid=23050259|pmc=3456489}}
* {{cite web|title=Western Blotting|publisher=Bio-Rad Laboratories|date=16. oktober 2012|website=YouTube|url=https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs}}
* {{cite web|title=Blotting Techniques/ The Principle of Western Blotting|date=23. mars 2017|publisher=Biomedical and Biological Sciences|website=YouTube|url=https://www.youtube.com/watch?v=BguNIPiCmv8&t=108s}}
* [http://www.westernblot.se Western blotting for Newbies] {{Wayback|url=http://www.westernblot.se/ |date=20210515202147 }}

[[Kategori:Molekylærbiologi]]