Redigerer DNA-sekvensering

[[Fil:DNA-Sequencers from Flickr 57080968.jpg|right|thumb|DNA-sekvenseringsmaskiner]]
Ved '''DNA-sekvensering''' finner man rekkefølgen av [[nukleotider]] i et [[DNA]]-[[molekyl]] eller et helt [[genom]]. Biter av sekvenser ble først sekvensert i 1975 (fra [[bakteriofag]] Phi X 174).<ref>{{cite journal |author=Air GM, Blackburn EH, Sanger F, Coulson AR|title=The nucleotide and amino acid sequences of the N (5') terminal region of gene G of bacteriophage phi X 174|journal=''Journal of Molecular Biology'' |volume=96 (4) |pages=703–719 |year=1975 }}</ref> Det første genomet til en frittlevende [[organisme]] ble sekvensert i 1995 (Haemophilus influenzae).

==Metoder==

De første metodene for DNA-sekvensering ble utviklet på midten av 1970-tallet. Maxam og Gilbert publiserte en metode som er basert på basespesifikk kjemisk spaltning, men denne metoden brukes nesten ikke lenger, fordi den trenger farlige kjemiske reagenser. Dessuten er den vanskeligere å automatisere enn [[Frederick Sanger|Sanger]] metoden som ble publisert det samme året.

I dag er det flere [[biokjemi]]ske og [[bioteknologi]]ske metoder som er beskrevet nedenfor. 

===Sanger Sekvensering===

Dideoxymetoden til Sanger er en såkalt [[enzym]]atisk sekvenseringsmetode som ble utviklet av Frederick Sanger og Alan Coulson omkring 1975. Med den første fullstendige genom sekvenseringen av [[bakteriofag]]en phi X 174 i 1977 ble metoden publisert<ref>{{cite journal |author=Sanger F, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Coulson AR, Fiddes CA, Hutchison CA, Slocombe PM, Smith M|title=Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA|journal=''Nature''|volume=265 (5596) |pages=687-695|year=1977 }}</ref>, og Sanger mottok [[Nobelprisen]] i kjemi sammen med Walter Gilbert i 1980.

=== Pyrosekvensering («Sequencing-by-Synthesis»)===

[[Pyrosekvensering]] bruker DNA-polymerase for syntesen av DNA-tråden. Forskjellen fra Sanger metoden er at man kan se at DNA-polymerasen henger på enkelt nukleotider på en nysyntetisert DNA-tråd. Dette blir omformet til en lysblits ved hjelp av enzymer.<ref name=Margulies>{{cite journal |author=Margulies M, Egholm M, Altman WE, ''et al'' |title=Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors |url=https://archive.org/details/sim_nature-uk_2005-09-15_437_7057/page/n102 |journal=''Nature'' |volume=437 |issue=7057 |pages=376–80 |year=2005 |month=september |pmid=16056220 |pmc=1464427 |doi=10.1038/nature03959 }}</ref> Lysblitsene kan registreres, og hvert par av lysintensitet og nukleotid gir en eller flere sammenhengende nukleotider av samme type der lengden er proporsjonal til lysintensiteten (et såkalt "homopolymer run", f.eks. AAA for lysintensitet på 3 og nukleotid A).

=== Utfordringer ===

Det egentlige problemet er ikke å bare lese sekvensen: På grunn av tekniske restriksjoner blir [[DNA]]et sekvensert i tusener av små enheter (engelsk: reads) og må settes sammen (engelsk: assemble) til en hel sekvens med [[bioinformatikk|bioinformatiske]] metoder fra [[sekvenssammenstilling]]en. Disse bitene (''reads'') er mindre enn 1000 bp ([[basepar]]). Et vanlig problem er store datamengder, som krever mye datakraft.

Pyrosekvenseringen blir mer og mer et alternativ til Sanger sekvensering. Read lengdene ligger på omtrent 400-500 basepar i den nyeste sekvenseringsgenerasjonen, "GS FLX Titanium", som ble publisert i 2008. Kvalitet av sekvenseringsdataene har blitt bedre i de siste årene, den er ofte målt i andel av feil nukleotider. 

Hvilken teknologi man velger for et sekvenseringsprosjekt er ofte avhengig av problemstillingen (de-novo sekvensering [sekvensering av noe nytt], resekvensering av et kjent genom, metagenomiske anvendelser osv.), størrelsen av genomet eller delen av genomet som skal bli sekvensert, tids- og pengeressurser, leselengden som trenges for anvendelsen osv.

== Historikk ==

* 1953: [[James Watson|Watson]] og [[Francis Crick|Crick]] oppdager strukturen av DNAs dobbelheliks.
* 1972: Utvikling av rekombinant DNA-teknologi som tillater at man kan isolere enkeltfragmenter av DNA. Før dette kunne man bare sekvensere bakteriofag eller virus DNA.
* 1975: Det første fullstendige DNA-genomet blir sekvensert, fra [[bakteriofag]] phi X 174. 
* 1977: Allan Maxam og Walter Gilbert publiserer artikkelen "DNA sekvensering ved kjemisk nedbryting", original tittel: "DNA sequencing by chemical degradation". Samtidig publiserer Frederick Sanger "DNA sequencing by enzymatic synthesis".
* 1980: [[Frederick Sanger]] og Walter Gilbert mottar [[Nobelprisen]] i kjemi 
* 1984: Vitenskapsfolk fra det engelske medisinske forskningsrådet, (Medical Research Council) finner og setter sammen hele DNA sekvensen for Epstein-Barr viruset, 170 kilobaser 
* 1986: Leroy E. Hood's laboratorium ved California Institute of Technology og Smith presenterer den første semi-automatiske DNA sekvenseringsmaskinen
* 1987: Applied Biosystems markedsfører den første helautomatiske DNA sekvenseringsmaskinen, modell ABI 370 
* 1990: U.S. National Institutes of Health (NIH) starter med stor-skala sekvensering forsøk på Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, og Saccharomyces cerevisiae. Kostnadene ligger på 75 US-cents/base.
* 1995: Richard Mathies et al. publiserer den såkalte ''dye-based'' (fargebaserte) sekvenseringen (der ulike farger blir brukt for å gjenkjenne de ulike basene).<ref>{{cite journal |author=Ju J, Ruan C, Fuller CW, Glazer AN, Mathies RA |title=Fluorescence energy transfer dye-labeled primers for DNA sequencing and analysis |journal=''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' |volume=92 |issue=10 |pages=4347–51 |year=1995 |month=mai |pmid=7753809 |pmc=41941 |doi=10.1073/pnas.92.10.4347 }}</ref>
*[[1996]] [[Pål Nyrén]] og hans student Mostafa Ronaghi ved det Kungliga Tekniska högskolan i Stockholm publiserte deres metode for [[pyrosekvensering]]<ref name=Ronaghi>{{cite journal| title=Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release| author=M. Ronaghi, S. Karamohamed, B. Pettersson, M. Uhlen, and P. Nyren| journal=Analytical Biochemistry| volume=242| pages=84–9| year=1996| doi=10.1006/abio.1996.0432}}</ref>
* 1998: Phil Green og Brent Ewing fra University of Washington publiserer «phred» for sekvensanalyse.<ref>{{cite journal |author=Ewing B, Green P |title=Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities |journal=''Genome Res.'' |volume=8 |issue=3 |pages=186–94 |year=1998 |month=mars |pmid=9521922 |url=http://www.genome.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=9521922}}</ref>
* 2005: 454 Life Sciences presenterer GS20 pyrosekvensering maskinen.
* 2007: 454 Life Sciences presenterer GS FLX versjonen.
* 2008: 454 Life Sciences presenterer GS FLX Titanium versjonen.

== Se også ==

* [[Bioinformatikk]]
* [[DNA]]
* [[Frederick Sanger]]
* [[Gen]]
* [[Genetikk]]
* [[Pyrosekvensering]]
* [[Sekvenssammenstilling]]

==Referanser==
<references/>

== Eksterne lenker ==
Om Maxam-Gilbert- og Sanger-sekvenseringen (engelsk):
* [https://web.archive.org/web/20080613163433/http://bio.kaist.ac.kr/~mbtlab/Lecture08.htm#MAXAM-GILBERT%20SEQUENCING Maxam-Gilbert Sekvensering]
* [https://web.archive.org/web/20080613163433/http://bio.kaist.ac.kr/~mbtlab/Lecture08.htm#SANGER-COULSON%20SEQUENCING Sanger-Coulson Sekvensering]

Om pyrosekvenseringen (engelsk):
* [http://www.youtube.com/watch?v=kYAGFrbGl6E Biotage Video Clip Pyrosequencing] 
{{Autoritetsdata}}

[[Kategori:Molekylærbiologi]]
[[Kategori:DNA]]
[[et:Sekveneerimine]]